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缺氧對GDH活性的影響 Presens搖瓶培養(yǎng)物中的氧監(jiān)測

更新時間:2023-01-10  |  點擊率:1266

image.png杯墊CFG上方的搖瓶用于讀取光學(xué)傳感器

     研究了不同栽培條件下谷棒狀桿菌和兩種不同白喉棒狀桿菌培養(yǎng)物中缺氧的影響。進行實驗以表征低氧濃度對氮代謝的特定酶 - 銨轉(zhuǎn)移酶谷氨酸脫氫酶(GDH)的影響。Oxgyen監(jiān)測使用PreSens的氧氣儀Fibox 3進行。所有測試的棒狀桿菌培養(yǎng)物的生長速率取決于氧氣供應(yīng),并且可用的氧氣越多,生長速率就越高。所研究的GDH活性似乎不受谷氨酸C.低氧水平的影響。在白喉衣原體培養(yǎng)物中,GDH活性在某些條件下增加,但只能確定非常低的活性值,這可能不顯著。

     銨的同化,被稱為谷氨酸C.的氮源,主要通過NADPH依賴性谷氨酸脫氫酶(GDH)完成。該酶將銨轉(zhuǎn)化為L-谷氨酸,這使得GDH成為一種生物技術(shù)上重要的酶,因為食品工業(yè)需要大量谷氨酸作為增味劑。因此,一個目標(biāo)是提高GDH的效率。在谷氨酸梭菌和白喉梭菌等需氧細(xì)菌中,氧限制會影響新陳代謝,也可能損害GDH活性。在T. Müller[2]先前的研究中,可以觀察到在氧氣排除下谷氨酸C. gdh的轉(zhuǎn)錄減少。以下實驗進一步研究了缺氧對谷氨酸衣原體和白喉梭菌培養(yǎng)物生長速率、GDH活性和GDH轉(zhuǎn)錄的影響。測試具有不同培養(yǎng)體積和振蕩速度的不同培養(yǎng)條件。Fibox 3與化學(xué)光學(xué)氧傳感器一起用于在整個培養(yǎng)期間培養(yǎng)物中的非侵入性氧監(jiān)測。

材料與方法

    實驗使用300 mL擋板玻璃搖瓶,其中一些在內(nèi)底壁上附有氧傳感器點(PreSens)。杯墊CFG是一個適配器,放置在傳感器點正對面的搖瓶下方,并通過PreSens連接到氧氣計Fibox 3以讀取傳感器響應(yīng)。在整個培養(yǎng)過程中以30秒的采樣率監(jiān)測和記錄氧氣濃度。本研究使用了谷氨酸梭菌ATCC13032野生型菌株和兩種白喉梭菌野生型菌株DSM44123和DSM43988[1]。為了檢查不同培養(yǎng)條件下的耗氧差異,在125 rpm的振蕩速度下,體積為25 mL、50 mL和100 mL,并在100 rpm和150 rpm的振蕩速度下測試了另外兩種50 mL體積的培養(yǎng)物。對于每一系列測試,在搖瓶中接種四個平行培養(yǎng)物。在每個系列中,取三個15mL樣品,每個樣品來自單獨的培養(yǎng)容器,用于谷氨酸脫氫酶活性測量和RNA雜交:0.5小時,2.5小時和6.5小時后。剩余的搖瓶裝有用于氧氣監(jiān)測的傳感器點。gdh DNA片段通過集落PCR擴增,隨后通過凝膠電泳純化,并用NucleoSpin®提取物試劑盒(Macherey-Nagel,Düren)提取。GDH活性按照T. Müller[2]的描述進行測量,并用以下公式計算:

活動 = (ΔA x V) / (ε x t x m x d)

     Delta A是吸光度降低,V是總反應(yīng)體積。Epsilon是消光系數(shù),t是反應(yīng)時間,m蛋白在反應(yīng)混合物中(mg)和d層厚度。用Roti-Quant®在oD下測量反應(yīng)混合物中的蛋白質(zhì)595.使用NucleoSpin® RNA II-Kit (Macherey-Nagel, Düren)進行總RNA的分離。標(biāo)記的RNA探針的合成和RNA雜交按照E. H?nssler的描述進行[3]。

圖1:不同體積(A)和不同振蕩速度(B)的谷氨酸梭菌培養(yǎng)物的氧濃度和oD。

圖2:谷氨酸梭菌培養(yǎng)物中的氧濃度和GDH活性(A);白喉衣原體DSM44123和DSM43988培養(yǎng)物中GDH活性的比較(B)。

氧氣消耗和增長率

       將培養(yǎng)0.5、2.5和6.5小時的氧氣水平與當(dāng)時的光密度進行比較(圖1)??梢杂^察到,谷氨酸衣原體和白喉衣原體的生長速率取決于氧氣供應(yīng)。不同的條件,如不同的振蕩速度和培養(yǎng)量,導(dǎo)致氧氣供應(yīng)的變化??傊?,可用的氧氣越多,生長速度就越高,與已知的數(shù)據(jù)相匹配。在培養(yǎng)快速生長的細(xì)菌(如谷氨酸梭菌)時,監(jiān)測生長速率和氧氣濃度的相關(guān)性非常重要。因為,例如,與以125 rpm搖動的培養(yǎng)物相比,用150 rpm搖動的谷氨酸C. glutamum培養(yǎng)物顯示出更低的氧氣水平,但OD更高,這可能導(dǎo)致氧氣隨著時間的推移而耗盡。像白喉梭菌這樣生長緩慢的細(xì)菌的耗氧量非常低,因此它幾乎與氧氣輸入保持平衡。在所有系列實驗中,耗氧量都超過了氧氣輸入,濃度降低。沒有系列達(dá)到氧氣限制。

缺氧對GDH的影響

      比較谷氨酸C. glutamum的GDH活性和氧氣消耗沒有顯示出很強的相關(guān)性(圖2A);氧氣的減少導(dǎo)致GDH活性的強弱下降。此外,在氧氣減少與gdh轉(zhuǎn)錄本量之間沒有顯著相關(guān)性。GDH活性的降低在6.5小時內(nèi)為0.25-0.7U / mg。這些值非常低,可能是由波動或其他調(diào)節(jié)過程的結(jié)果引起的。然而,不能排除氧氣消耗對GDH活性的影響。與谷氨酸衣原體相比,在某些培養(yǎng)條件下,在白喉梭菌的兩個菌株中都可以觀察到GDH活性略有增加(圖2B)。但是測量值真的很低,可能并不重要。兩種白喉菌株培養(yǎng)過程中氧濃度均或多或少降低,GDH活性均增加和降低。白喉衣原體DSM44123的斑點印跡顯示轉(zhuǎn)錄本增加(25mL / 125rpm除外),這與GDH活性測量無關(guān)。這可能表明谷氨酸脫氫酶在轉(zhuǎn)錄后受到調(diào)節(jié)。白喉梭菌DSM43988菌株中的斑點印跡和GDH活性測量或多或少匹配,但與白喉梭菌DSM 44123獲得的結(jié)果不匹配。由于兩種菌株的結(jié)果不同,無法得出關(guān)于缺氧對白喉衣原體GDH的影響的明確結(jié)論。

結(jié)論與觀點

       在測試的培養(yǎng)條件下,在谷氨酸衣原體和白喉衣原體的培養(yǎng)物中,氧濃度對GDH活性沒有一定的影響。由于只能測量非常低的GDH活性值,因此必須使用大量蛋白質(zhì)進行進一步的測試。谷氨酸梭菌培養(yǎng)的結(jié)果并未證實在T. Müller研究中觀察到的預(yù)期影響[2]。其他條件可能必須進行測試,例如以更低的搖晃速率或不搖晃進行栽培。由于氧氣的減少有望降低GDH活性,因此相反的方法 - 額外的氧氣輸入 - 可以提供更詳細(xì)的見解。這些新方法可能會為GDH活性測量提供更好或更顯著的結(jié)果


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