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使用Presens SFR 一次性搖瓶培養(yǎng)條件的測定和設(shè)計(jì)

更新時(shí)間:2023-01-10  |  點(diǎn)擊率:995

       溶解氧(DO)是好氧培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵參數(shù),由于其溶解度低,氧氣在某些培養(yǎng)條件下會(huì)受到限制。本研究開發(fā)了一種預(yù)測一次性搖瓶中不同培養(yǎng)條件下氧轉(zhuǎn)移速率、氧飽和度和最大細(xì)胞濃度的新方法。因此,確定體積氣液傳質(zhì)系數(shù)(kLa)從灌裝量、容器尺寸和攪拌速度已經(jīng)確定。使用SFR搖瓶讀數(shù)儀進(jìn)行氧氣測量。谷氨酸棒狀桿菌的測試表明,使用這種新方法可以實(shí)現(xiàn)可靠的培養(yǎng)條件設(shè)計(jì),并且可以不受限制地預(yù)測最大可能的細(xì)胞濃度。

圖1:本研究使用了帶有集成化學(xué)光學(xué)傳感器(SFS,PreSens)的擋板(左)和非擋板(右)一次性搖瓶。

       搖瓶具有多種優(yōu)點(diǎn),例如易于操作和高通量,因此廣泛用于研究和工業(yè)。這就是為什么已經(jīng)在幾項(xiàng)研究中研究了搖瓶中的溶解氧濃度和傳質(zhì)。然而,這些信息從未用于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的初步考慮,或好氧培養(yǎng)中DO的預(yù)測,盡管這將具有顯著的優(yōu)勢并防止由于氧氣限制而導(dǎo)致的失敗。在這項(xiàng)研究中,我們開發(fā)了一種可靠預(yù)測有氧生長過程中氧飽和度的方法。隨著帶有集成傳感器的一次性培養(yǎng)容器市場不斷增長,我們的實(shí)驗(yàn)集中在這種類型的塑料搖瓶上。我們對(duì) k 進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查L一個(gè)帶和不帶擋板的一次性搖瓶,并使用SFR搖瓶閱讀器實(shí)現(xiàn)氧氣監(jiān)測,允許在容器中進(jìn)行在線監(jiān)測。得到的 k 的數(shù)學(xué)相關(guān)性L然后對(duì)谷氨酸梭菌的模型培養(yǎng)進(jìn)行計(jì)算,并事先確定在沒有氧氣限制的情況下可以獲得的最大細(xì)胞濃度。

圖2:k的相關(guān)性La,30°C下填充體積為10%的擋板搖瓶的燒瓶尺寸和振蕩頻率。

     圖3:以葡萄糖為碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中谷氨酸的生長和耗氧量。在250 mL擋板搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng),填充體積為30%(A)和10%填充體積(B),轉(zhuǎn)速為150rpm。該設(shè)置中的非氧限制期(灰色區(qū)域)用于確定比生長速率、μ和比攝氧速率 qO2預(yù)測值(藍(lán)色)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(黑色)顯示出好的一致性(B)。

材料與方法

      kLa在不同尺寸(125、250、500 mL)的擋板和非擋板搖瓶中定量,并帶有集成的氧氣和pH傳感器(SFS傳感器燒瓶,PreSens)。在100 mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中,在30和37°C的軌道搖床中進(jìn)行測量,振蕩直徑為50 mm。 使用SFR搖瓶讀數(shù)儀(PreSens)實(shí)現(xiàn)溶解氧監(jiān)測。搖瓶用緩沖液和Co(NO)平衡3)2(0.1 毫米)。通過添加 200 gL 獲得缺氧-1那2所以3儲(chǔ)備溶液。工作體積(10 - 40 %最大填充量)和振蕩頻率(50、150、250 rpm)各不相同,所有測量一式三份進(jìn)行。kLa使用Berkley MADONNA(Ver.8.0.1)測定血氧飽和度的20-90%。對(duì)于 kL估計(jì)值、燒瓶大小、振蕩頻率和 K 之間的經(jīng)驗(yàn)相關(guān)性La 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯編。數(shù)學(xué)擬合要么使用高斯函數(shù),要么使用拋物線函數(shù)[1]。C. 谷氨酸ATCC 13032用礦物鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)物在250mL擋板搖瓶(SFS,PreSens)中生長,溫度為30°C,150rpm,填充體積為10%或30%。后者用于確定比生長速率和比攝氧速率。這些實(shí)驗(yàn)確定的生長和攝氧值用于預(yù)測谷氨酸梭菌在30 °C,150 rpm下在250 mL搖瓶中以10%填充體積生長期間生物質(zhì)濃度的增加和DO的降低。

kL搖瓶中的定量

      kLa是通過在充滿緩沖液的擋板和非擋板搖瓶中進(jìn)行在線氧氣監(jiān)測來確定的。通過添加Na去除氧氣2所以3到系統(tǒng)。當(dāng)氧化還原反應(yīng)由Co催化2+完成,燒瓶內(nèi)的溶解氧增加,可用于測定KLa 對(duì)于給定條件。對(duì)于所研究的搖瓶,kL值長達(dá)350小時(shí)-1都下定了。對(duì)于無擋板搖瓶,kLA 總體較低,最大 KLa 值為 100 小時(shí)-1[1]. 搖晃頻率對(duì)氧氣轉(zhuǎn)移的影響顯著。容器尺寸對(duì)k幾乎沒有任何統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)影響La的無擋板搖瓶,但對(duì)k有一定影響L一個(gè)在困惑的燒瓶中。從30°C到37°C的溫升幾乎沒有影響kL一個(gè)。然而,對(duì)于每個(gè)研究的填充體積,在30和37°C下建立了個(gè)體相關(guān)性。在圖2中,這是在30°C下以10%填充體積的擋板搖瓶所示的。獲得了k的高斯擬合的優(yōu)參數(shù)估計(jì)L擋板燒瓶和 K 拋物線擬合的值La 非擋板燒瓶的值。

谷氨酸的生長和耗氧量

      圖3 A顯示了谷氨酸梭菌培養(yǎng)物在250 mL搖瓶中的生長和耗氧量,填充量為30%,振蕩頻率為150 rpm??梢杂^察到,DO下降得非???,并在4小時(shí)后變得受限。測定生長和攝氧量至0.38小時(shí)-1和 14.2 毫摩爾克-1h-1分別。這些值用于預(yù)測細(xì)胞生長的時(shí)間過程和在另一個(gè)迄今為止未經(jīng)測試的條件下培養(yǎng)谷氨酸梭菌的溶解氧。計(jì)算在250 mL擋板搖瓶中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)置,填充率為10%,振蕩頻率為150 rpm。kLa計(jì)算至190小時(shí)-1接種物濃度為 0.2 g CDW L-1確定細(xì)胞生長的時(shí)間過程,如圖3 B(藍(lán)色實(shí)線)所示;考慮到所有參數(shù),計(jì)算了DO(藍(lán)色虛線)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和監(jiān)測培養(yǎng)性能時(shí),可以驗(yàn)證氧氣消耗量確實(shí)得到了很好的預(yù)測。實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值幾乎相同。限制氧氣供應(yīng)時(shí)的預(yù)期細(xì)胞濃度(4.3 g L-1) 也與實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)的 4.6 ± 0.3 g L 的細(xì)胞濃度相匹配-1在 20% 的 DO 下。

結(jié)論

      本研究結(jié)果清楚地表明,該方法可用于預(yù)測一次性搖瓶的最佳培養(yǎng)條件和耗氧量。隨著已建立的相關(guān)性 kL計(jì)算可以從基于緩沖液的系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)搖瓶培養(yǎng)。預(yù)測特定實(shí)驗(yàn)裝置的氧氣可用性的能力可以顯著改善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。SFR系統(tǒng)專為一次性搖瓶中的氧氣監(jiān)測而設(shè)計(jì),在這項(xiàng)研究中被證明是一個(gè)有價(jià)值的工具,為這種新方法的開發(fā)及其后續(xù)驗(yàn)證提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。


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