圖1:搖床內(nèi)部的設置:將搖瓶放置在杯
在這項研究中,已經(jīng)建立了搖瓶規(guī)模的反饋控制縮小模型。使用集成在搖瓶中的化學光學傳感器(PSt3型)測量釀酒酵母培養(yǎng)物中的溶解氧(DO)濃度。溶解氧水平觸發(fā)了按需碳進料。這種設置允許在搖瓶中進行自動補料分批培養(yǎng),并提高在此規(guī)模下獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量,而不會影響結(jié)果的數(shù)量。搖瓶培養(yǎng)中的不同菌株與生物反應器規(guī)模表現(xiàn)出相同的排名。在第二個實驗中,在反饋控制系統(tǒng)中測試了DO-stat和碳限制過程。結(jié)果表明,采用該裝置,該過程可以在搖瓶規(guī)模下成功進行。
圖2:釀酒酵母在按需喂養(yǎng)搖瓶設置中的培養(yǎng)。
圖3:四種釀酒酵母菌株在搖晃片尺度(藍色)和生物反應器量表(紅色)下的比較:細胞干重(頂部),產(chǎn)物濃度(中)和相對生產(chǎn)參數(shù)Ypx(底部)。
圖4:DO-Stat:碳限制過程;DO設定值 20 %。
在用于生產(chǎn)藥物、蛋白質(zhì)或營養(yǎng)添加劑的生物工藝開發(fā)中,在測試合適的細胞系、培養(yǎng)基組成和工藝條件時,使用縮小模型來節(jié)省時間和成本。然而,通常很難確定小規(guī)模工藝放大的關鍵參數(shù)。搖瓶通常用于生物技術研究和生產(chǎn)。它們代表了昂貴的大規(guī)模生物反應器系統(tǒng)的低成本替代品,并且更容易處理。另一方面,沒有建立在線監(jiān)測和控制這種規(guī)模的重要培養(yǎng)參數(shù)的系統(tǒng)。需要一種可靠的自動進料方法和消除手動取樣,以改善搖瓶規(guī)模的生物工藝開發(fā)。在這些實驗中,測試了可用于搖瓶培養(yǎng)的反饋控制系統(tǒng)。培養(yǎng)物中的溶解氧含量觸發(fā)碳源飼料,PreSens使用化學光學傳感器技術在線測量。氧傳感器集成在玻璃錐形瓶的底部,并通過透明燒瓶壁非侵入性地讀取。傳感器信號被傳輸?shù)?OXY-10 mini,這是一款 10 通道氧計,可在多達 10 個搖瓶中同時在線測量。使用蠕動泵,根據(jù)需要自動將葡萄糖溶液添加到培養(yǎng)物中。在釀酒酵母培養(yǎng)物中按需使用脈沖飼料進行測試,并將結(jié)果與生物反應器規(guī)模(20 L)獲得的值進行比較。此外,該系統(tǒng)還用于測試碳限制過程,用于提高生物質(zhì)和產(chǎn)品產(chǎn)量,其中DO試圖保持在20%左右。
材料與方法
在 工作體積為100 mL的500 mL玻璃搖瓶中進行實驗,在2.5 cm投擲時搖晃速率為< 250 rpm,或在5.0 cm投擲時<200 rpm。每個燒瓶的底部都有一個氧傳感器點,并放置在Coaster CFG的頂部。杯墊是一種附件,可以將傳感器信號傳輸?shù)窖鯕庥嫛XY-10 mini通過RS232連接到Lantronix S2E轉(zhuǎn)換器,該轉(zhuǎn)換器連接到AdamBus A / D轉(zhuǎn)換器。AdamBus A/D-轉(zhuǎn)換器控制蠕動泵進行進料。一臺帶有Lucullus PIMS的PC用于從Lantronix S2E轉(zhuǎn)換器收集數(shù)據(jù)并監(jiān)控過程。每個搖瓶連接到帶有硅膠或藥用管(直徑12 - 16管)的單個蠕動泵,允許0 - 50 g / h的流量。將試管連接到搖瓶蓋上(見圖1)。實際進料速率是通過流量與泵速的相關性計算的。首先,在8個搖瓶中對四種不同的釀酒酵母菌株進行實驗,一式兩份。根據(jù)需要將500 g / L葡萄糖溶液作為碳源以0.5小時的脈沖以20 g / h的進料速率給予培養(yǎng)物。進給速率和脈沖時間是經(jīng)驗值。當ΔDO/10分鐘>10%時觸發(fā)進料啟動。在第二個實驗中,釀酒酵母試圖在碳限制過程中保持在靜態(tài)DO。使用150 g/L葡萄糖溶液,當ΔDO/10 min>10 %時再次觸發(fā)進料啟動。使用簡單的兩步控制器將溶解氧保持在20%的設定值,增量為0.5%。
結(jié)果
按需饋送實驗運行96小時(見圖2)。在第一階段,初始葡萄糖被消耗,并且由于釀酒酵母的雙氧生長部分轉(zhuǎn)化為乙醇。細胞的生長導致溶解氧水平降低,并且在大約22小時(DO信號中的小峰)葡萄糖耗盡并且乙醇繼續(xù)生長。由于搖瓶的氧氣轉(zhuǎn)移能力有限,DO水平在40小時左右達到零。當乙醇也耗盡時,培養(yǎng)基中不存在其他碳源,導致細胞對氧的吸收減少,因此溶解氧水平升高。這種增加被用作葡萄糖添加的觸發(fā)因素。一旦再次消耗添加的葡萄糖和產(chǎn)生的乙醇,就開始下一個添加物。將搖瓶設置中四種釀酒酵母菌株的干重和產(chǎn)量與在生物反應器規(guī)模(20 L)下相同菌株獲得的結(jié)果進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)搖瓶培養(yǎng)物的細胞干重和產(chǎn)物濃度達到較低的輸出(圖3),這是由生物反應器的較高氧轉(zhuǎn)移容量引起的。然而,所有菌株在兩個栽培規(guī)模上都表現(xiàn)出相同的排名,這使得能夠挑選具有特殊特征的菌株用于以后的放大過程。相對生產(chǎn)參數(shù)的比較顯示,搖瓶培養(yǎng)值與生物反應器規(guī)模的培養(yǎng)值具有良好的一致性(圖3)。在第二個實驗中,自動搖瓶系統(tǒng)在具有靜態(tài)DO的碳限制培養(yǎng)中進行了測試。 圖4顯示自動飼喂系統(tǒng)可用于進行DO-Stat培養(yǎng)。當溶解氧水平低于設定值時,進給速率降低,反之亦然。所選參數(shù)(0.5%進給速率增量,1小時步進時間)已經(jīng)產(chǎn)生了非常好的溶氧控制。使用定義的工藝條件進行進一步微調(diào)可以降低溶解氧信號的振蕩。
結(jié)論
開發(fā)的用于搖瓶培養(yǎng)的按需飼喂系統(tǒng)顯示出良好的效果,與生物反應器規(guī)模的值進行比較,可以得出結(jié)論,可以在此規(guī)模下比較和挑選不同的菌株。此外,在此設置中進行的測試非常節(jié)省時間。在生物反應器規(guī)模下只能運行 2 或 3 個實驗的情況下,該系統(tǒng)允許每周進行 8 - 10 次測試。即使在碳限制過程中,系統(tǒng)也取得了意想不到的良好結(jié)果。在縮小比例過程中進行實驗時,能夠與PreSens OXY-10 mini同時在線和在多個搖瓶中測量溶解氧是一個重要優(yōu)勢。SFR 搖瓶讀數(shù)儀允許在多達 9 個搖瓶中測量氧氣和 pH 值,進一步實驗可能會增強這種自動化且部分可控的搖瓶秤系統(tǒng)。已經(jīng)計劃進一步開發(fā)設置