杯墊CFG上方的搖瓶用于讀取光學(xué)傳感器
研究了不同栽培條件下谷棒狀桿菌和兩種不同白喉棒狀桿菌培養(yǎng)物中缺氧的影響。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以表征低氧濃度對(duì)氮代謝的特定酶 - 銨轉(zhuǎn)移酶谷氨酸脫氫酶(GDH)的影響。Oxgyen監(jiān)測(cè)使用PreSens的氧氣儀Fibox 3進(jìn)行。所有測(cè)試的棒狀桿菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率取決于氧氣供應(yīng),并且可用的氧氣越多,生長(zhǎng)速率就越高。所研究的GDH活性似乎不受谷氨酸C.低氧水平的影響。在白喉衣原體培養(yǎng)物中,GDH活性在某些條件下增加,但只能確定非常低的活性值,這可能不顯著。
銨的同化,被稱為谷氨酸C.的氮源,主要通過(guò)NADPH依賴性谷氨酸脫氫酶(GDH)完成。該酶將銨轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-谷氨酸,這使得GDH成為一種生物技術(shù)上重要的酶,因?yàn)槭称饭I(yè)需要大量谷氨酸作為增味劑。因此,一個(gè)目標(biāo)是提高GDH的效率。在谷氨酸梭菌和白喉梭菌等需氧細(xì)菌中,氧限制會(huì)影響新陳代謝,也可能損害GDH活性。在T. Müller[2]先前的研究中,可以觀察到在氧氣排除下谷氨酸C. gdh的轉(zhuǎn)錄減少。以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了缺氧對(duì)谷氨酸衣原體和白喉梭菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)速率、GDH活性和GDH轉(zhuǎn)錄的影響。測(cè)試具有不同培養(yǎng)體積和振蕩速度的不同培養(yǎng)條件。Fibox 3與化學(xué)光學(xué)氧傳感器一起用于在整個(gè)培養(yǎng)期間培養(yǎng)物中的非侵入性氧監(jiān)測(cè)。
材料與方法
實(shí)驗(yàn)使用300 mL擋板玻璃搖瓶,其中一些在內(nèi)底壁上附有氧傳感器點(diǎn)(PreSens)。杯墊CFG是一個(gè)適配器,放置在傳感器點(diǎn)正對(duì)面的搖瓶下方,并通過(guò)PreSens連接到氧氣計(jì)Fibox 3以讀取傳感器響應(yīng)。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中以30秒的采樣率監(jiān)測(cè)和記錄氧氣濃度。本研究使用了谷氨酸梭菌ATCC13032野生型菌株和兩種白喉梭菌野生型菌株DSM44123和DSM43988[1]。為了檢查不同培養(yǎng)條件下的耗氧差異,在125 rpm的振蕩速度下,體積為25 mL、50 mL和100 mL,并在100 rpm和150 rpm的振蕩速度下測(cè)試了另外兩種50 mL體積的培養(yǎng)物。對(duì)于每一系列測(cè)試,在搖瓶中接種四個(gè)平行培養(yǎng)物。在每個(gè)系列中,取三個(gè)15mL樣品,每個(gè)樣品來(lái)自單獨(dú)的培養(yǎng)容器,用于谷氨酸脫氫酶活性測(cè)量和RNA雜交:0.5小時(shí),2.5小時(shí)和6.5小時(shí)后。剩余的搖瓶裝有用于氧氣監(jiān)測(cè)的傳感器點(diǎn)。gdh DNA片段通過(guò)集落PCR擴(kuò)增,隨后通過(guò)凝膠電泳純化,并用NucleoSpin®提取物試劑盒(Macherey-Nagel,Düren)提取。GDH活性按照T. Müller[2]的描述進(jìn)行測(cè)量,并用以下公式計(jì)算:
活動(dòng) = (ΔA x V) / (ε x t x m x d)
Delta A是吸光度降低,V是總反應(yīng)體積。Epsilon是消光系數(shù),t是反應(yīng)時(shí)間,m蛋白在反應(yīng)混合物中(mg)和d層厚度。用Roti-Quant®在oD下測(cè)量反應(yīng)混合物中的蛋白質(zhì)595.使用NucleoSpin® RNA II-Kit (Macherey-Nagel, Düren)進(jìn)行總RNA的分離。
圖1:不同體積(A)和不同振蕩速度(B)的谷氨酸梭菌培養(yǎng)物的氧濃度和oD。
圖2:谷氨酸梭菌培養(yǎng)物中的氧濃度和GDH活性(A);白喉衣原體DSM44123和DSM43988培養(yǎng)物中GDH活性的比較(B)。
氧氣消耗和增長(zhǎng)率
將培養(yǎng)0.5、2.5和6.5小時(shí)的氧氣水平與當(dāng)時(shí)的光密度進(jìn)行比較(圖1)??梢杂^察到,谷氨酸衣原體和白喉衣原體的生長(zhǎng)速率取決于氧氣供應(yīng)。不同的條件,如不同的振蕩速度和培養(yǎng)量,導(dǎo)致氧氣供應(yīng)的變化??傊?,可用的氧氣越多,生長(zhǎng)速度就越高,與已知的數(shù)據(jù)相匹配。在培養(yǎng)快速生長(zhǎng)的細(xì)菌(如谷氨酸梭菌)時(shí),監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)速率和氧氣濃度的相關(guān)性非常重要。因?yàn)?,例如,與以125 rpm搖動(dòng)的培養(yǎng)物相比,用150 rpm搖動(dòng)的谷氨酸C. glutamum培養(yǎng)物顯示出更低的氧氣水平,但OD更高,這可能導(dǎo)致氧氣隨著時(shí)間的推移而耗盡。像白喉梭菌這樣生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌的耗氧量非常低,因此它幾乎與氧氣輸入保持平衡。在所有系列實(shí)驗(yàn)中,耗氧量都超過(guò)了氧氣輸入,濃度降低。
缺氧對(duì)GDH的影響
比較谷氨酸C. glutamum的GDH活性和氧氣消耗沒(méi)有顯示出很強(qiáng)的相關(guān)性(圖2A);氧氣的減少導(dǎo)致GDH活性的強(qiáng)弱下降。此外,在氧氣減少與gdh轉(zhuǎn)錄本量之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。GDH活性的降低在6.5小時(shí)內(nèi)為0.25-0.7U / mg。這些值非常低,可能是由波動(dòng)或其他調(diào)節(jié)過(guò)程的結(jié)果引起的。然而,不能排除氧氣消耗對(duì)GDH活性的影響。與谷氨酸衣原體相比,在某些培養(yǎng)條件下,在白喉梭菌的兩個(gè)菌株中都可以觀察到GDH活性略有增加(圖2B)。但是測(cè)量值真的很低,可能并不重要。兩種白喉菌株培養(yǎng)過(guò)程中氧濃度均或多或少降低,GDH活性均增加和降低。白喉衣原體DSM44123的斑點(diǎn)印跡顯示轉(zhuǎn)錄本增加(25mL / 125rpm除外),這與GDH活性測(cè)量無(wú)關(guān)。這可能表明谷氨酸脫氫酶在轉(zhuǎn)錄后受到調(diào)節(jié)。白喉梭菌DSM43988菌株中的斑點(diǎn)印跡和GDH活性測(cè)量或多或少匹配,但與白喉梭菌DSM 44123獲得的結(jié)果不匹配。由于兩種菌株的結(jié)果不同,無(wú)法得出關(guān)于缺氧對(duì)白喉衣原體GDH的影響的明確結(jié)論。
結(jié)論與觀點(diǎn)
在測(cè)試的培養(yǎng)條件下,在谷氨酸衣原體和白喉衣原體的培養(yǎng)物中,氧濃度對(duì)GDH活性沒(méi)有一定的影響。由于只能測(cè)量非常低的GDH活性值,因此必須使用大量蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試。谷氨酸梭菌培養(yǎng)的結(jié)果并未證實(shí)在T. Müller研究中觀察到的預(yù)期影響[2]。其他條件可能必須進(jìn)行測(cè)試,例如以更低的搖晃速率或不搖晃進(jìn)行栽培。由于氧氣的減少有望降低GDH活性,因此相反的方法 - 額外的氧氣輸入 - 可以提供更詳細(xì)的見(jiàn)解。這些新方法可能會(huì)為GDH活性測(cè)量提供更好或更顯著的結(jié)果